Виды эмбрионально-клеточной биопсии
Для проведения преимплантационной диагностики (PID) необходимо получить клеточный материал эмбриона. Этот материал нужен для разносторонних биологических и молекулярно-генетических исследований, позволяющих установить или исключить передачу наследственных заболеваний, генетических и хромосомных дефектов.
Сам эмбрион к моменту PID пребывает еще в лабораторных условиях. Он получен методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и проходит стадию первичного развития в специальном инкубаторе.
Собственно, сама эта стадия тоже включает в себя несколько стадий:
- стадия первичного деления;
- стадия формирования бластоцисты.
При первичном делении эмбрион увеличивается до 6-10 клеток. Бластоциста состоит уже из нескольких десятков или сотен клеток. Обнаруживается и начальная клеточная специализация – клетки бластоцисты делятся на две популяции: внешнюю (трофобласт) и внутреннюю (эмбриобласт).
На каждой из этих стадий возможно проведение клеточной биопсии (взятие отдельных клеток для микроскопических исследований).
Удивительно, но клеточную биопсию можно проводить и на более ранней стадии, до формирования эмбриона – и даже до завершения искусственного оплодотворения. Это методика префертилизационной диагностики (Präfertilisationsdiagnostik). Биопсия проводится после проникновения сперматозоида в яйцеклетку, но до завершения их слияния, при котором объединяются ядра мужской и женской половых клеток. В ходе биопсии у оплодотворенных яйцеклеток забирают так называемые полярные тельца (Polkörper), предваряющие стадию первичного деления. Полярные тельца содержат набор родительских хромосом. Набор еще не парный, а одинарный (гаплоидный) – но и в таком наборе хромосомы поддаются диагностическому изучению.
Словом, конкретные виды биопсии подразделяются в зависимости от стадии проведения:
- На стадии оплодотворения – биопсия полярных телец (Polkörperbiopsie, или PKB). Берутся одно-два тельца от оплодотворяемой яйцеклетки.
- На стадии начального эмбрионального деления – биопсия бластомеров (Blastomerenbiopsie). Берутся один-два бластомера (первичные клетки эмбриона).
- На стадии формирования бластоцисты – биопсия ее клеток (Blastozystenbiopsie). Берется небольшое число поверхностных клеток (трофобласта).
До недавнего времени биопсия бластомеров была центральной процедурой преимплантационной диагностики. Сейчас все чаще проводятся, в зависимости от конкретных целей, либо биопсия полярных телец, либо биопсия бластоцисты.
Биопсия бластомеров
Она производится на этапе, когда эмбрион состоит в среднем из восьми клеток-бластомеров.
Клетки эмбриона окружены «блестящей оболочкой» (Zona pellucida). Необходимо проникнуть сквозь нее, чтобы добраться до бластомеров. Прежняя методика была такова: намеченный для проникновения крохотный участок «блестящей оболочки» разъедали сложным физиологическим раствором (так называемый кислый раствор Рингера – Тироде). В настоящее время поверхностную оболочку пунктируют лазером: процедура точная и безопасная. В место прокола вводят биоптический капилляр, им отбирают подходящий для исследования бластомер (или, для надежности, пару). Подходящими признаются бластомеры с хорошо различимыми ядрами. Это важно для последующего извлечения и изучения цепочек ДНК.
Если найден один бластомер, отвечающий всем требованиям, то второй уже не ищут. Биопсия двух бластомеров повышает риск неприятных побочных последствий, которые могут сказаться при имплантации эмбриона в матку и при последующем, фетальном развитии плода.
Вообще, из-за риска побочных действия биопсия бластомеров проводится ныне лишь в редких случаях.
Биопсия полярных телец
Полярные тельца возникают в яйцеклетке на этапе подготовки первичного мейотического деления. Для последующего развития яйцеклетки и эмбриона эти тельца не нужны. Но поскольку они содержат хромосомный набор будущего организма, то дают хороший материал для генетической диагностики эмбриона, которому еще только предстоит сформироваться.
Полярные тельца формируются в яйцеклетке по очереди, сначало первое, потом второе. Биопсию проводят через шесть часов после образования второго тельца. Соответственно этому рассчитывают и время оплодотворения яйцеклетки, чтобы биопсию телец можно было провести примерно через два часа после внедрения сперматозоида (до истечения этого времени яйцеклетка слишком чувствительна, внешнее раздражение может ей повредить).
Как и при биопсии бластомеров, необходимо проникнуть под «блестящую оболочку», которая в данном случае выступает поверхностной защитой яйцеклетки. Но кислый раствор Рингера – Тироде применять нельзя. У яйцеклеток пониженный кислотно-щелочной баланс, поступление кислой фракции нарушит ее развитие. Прежде проводили механическое «пробуравливание», сейчас его все чаще заменяет лазерная пункция.
Тельца собираются биоптическим капилляром, введенным через лазерный «прокол». Если тельца фрагментированы, то необходимо собрать все фрагменты, поскольку в них «рассеян» хромосомный набор.
Биопсия бластоцисты
Она проводится на пятый день после оплодотворения и позволяет исследовать широкий набор хромосомных слагаемых, доставшихся эмбриону от родителей, и его собственное генетическое устройство.
Для исследований отбираются клетки трофэктодермы (поверхностного слоя бластоцисты). Из этого слоя после имплантации эмбриона в матку формируется плацента. Внутрение клетки не извлекаются. Таким образом биопсия не является «проникновением в тело эмбриона».